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　　利用胚胎移植技术加快良种牛的繁殖速度是目前世界各国普遍采用的生物技术。在胚胎移植中，通常采用超数排卵法获得优良胚胎，但是该方法效率低下，成本较高。八十年代以来，发达国家对体外受精胚胎生产技术进行了广泛的研究，取得了突破性进展。目前，牛胚胎的实验室生产技术在许多发达国家已成为常规技术。实验室胚胎生产技术的完善不仅在实际生产中具有重大经济意义，可以生产大量廉价胚胎，而且成为理论研究的重要技术手段。一些高新技术，如克隆动物的生产、转基因动物的生产等等都必须以实验室胚胎培养技术为基础。

　　目前，牛胚胎的实验室培养技术主要有两种方法。一种是共培养系统。该系统首先必须在培养皿上贴壁培养输卵管上皮细胞、颗粒细胞等，然后将受精卵和贴壁培养的上皮细胞一起培养，直至生产出可用胚胎。共培养系统是一种操作复杂、费时、费力的胚胎培养方法。另一种是人工合成输卵管液（SOF0培养系统，相对而言，该方法操作比较简单，而且经过近年来的研究和完善，SOF培养系统的培养效果已达到甚至超过共培养系统。本文将简要介绍作者在新西兰草地农业研究所学习期间进行的生产牛胚胎。作者在新西兰期间，共使用了150个屠宰卵巢，进行了六批体外受精胚胎生产实验。下面将实验方法及实验结果作一介绍。

　　1 实验材料和方法

　　1.1 卵母细胞的准备

　　从当地的一个屠宰场收集实验所用的卵巢。所有卵巢用保温瓶在29.5-30.5℃的生理盐水中运回实验室。实验开始前，用肥皂清洗双手。将卵巢转换到广口保温瓶中，倒入温生理盐水至浸没卵巢，用手清洗卵巢，尽量将卵巢上的血液洗净。用真空泵或注射器吸取卵巢上直径2—6mm的有腔卵泡，将卵泡液连同卵母细胞复合体（COCS）放入事先添加吸卵液的试管中（试管放置在30-35℃的恒温孔中）。

　　1.1.1 卵母细胞的体外成熟培养（IVM）

　　IVM培养小滴的制备

　　在吸取卵母细胞前至少2小时制备IVM小滴。IVM小滴的制备必须在超净工作台操作。用微量移液器吸取40μlIVM 培养液，滴于直径60mm的培养皿中，每个培养皿制备10小滴IVM。小滴制备完毕后，覆盖上矿物油。在培养皿盖上标记上培养液名称、制备日期和操作者姓名，放入CO2培养箱中平衡至少2小时。平衡条件为39℃、5% CO2的空气。

　　1.1.2 卵母细胞的洗涤和成熟培养

　　所有操作必须在显微镜恒温台上（38℃）和恒温箱中（38℃）进行，并保持室温在25℃左右，在大培养皿中加入吸卵液后，用2毫升的巴氏玻璃管从试管底部吸取卵母细胞，置入培养皿中。在显微镜下查找卵母细胞，将可用卵母细胞移置加有H199+10%FCS的35MM培养皿中。将卵母细胞再在B199+10%FCS的培养皿中洗涤一次，立即将卵母细胞转移至IVM培养小滴中（10个卵母细胞/小滴）进行成熟培养。培养条件为39摄氏度、5%二氧化碳的空气。培养时间为22?4小时。

　　1.2 卵母细胞的体外受精（IVF）

　　1.2.1 IVF培养小滴的制备

　　用微量移杯吸管取30微毫升IVF的培养液，在60MM培养皿中制备10个IVF小滴，覆盖上矿物油，在39摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中平衡至少2小时。

　　1.2.2 精子的获取处理

　　事先在超净的工作台制备90%和45%的PERCOLL液，备用。在15毫升离心管中加入2毫升45%的PERCOLL液，制备成二层PERCOLL梯度液。将一只解冻液（冷冻活力一般需在0.5以上）沿试管壁漫漫加入离心管中，在700克下（2200转/分钟）离心至少20分钟。离心后，马上用巴氏吸管吸取PERCOLL上清液，弃掉。然后，再沿管壁漫漫加入HSOF液1毫升，轻轻摇晃离心管，使其混合后，再200克下（1200转/分钟）再离心15分钟。弃掉上清液，加入200微毫升IVF培养液。取10微毫升精子制备液，将其加入190微毫升蒸馏水中，混合均匀，取该精子液再血球记数板上测定精子密度。根据精子密度确定需要补充的IVF液，以便使精子的最终受精密度达到2X106个/毫升（计算公式可参考有关精子密度测定法）。

　　1.2.3 精子和卵母细胞体外受精的培养

　　将成熟卵母细胞从IVF小滴中取出，在HSOF液中洗涤一次。然后用10微毫升IVF液，将卵母细胞移至IVF小滴中。在加入10微毫升处理后的精子液体，使精子的受精密度达到2X106个/毫升。最后放入培养箱中，在39摄氏度、5%二氧化碳的空气条件下培养24-26小时。

　　1.3 受精卵的发育培养（IVF）

　　1.3.1 IVC小滴的制备

　　用微量移液器在超净工作台上吸取20微毫升ESOF（用与早期胚胎培养的人工合成输卵管培养液），在35MM培养皿上制备IVC小滴。通常每个培养皿制备5滴IVC小滴，中间一滴为40微毫升IVC，用于洗涤胚胎。IVC小滴制备后，覆盖矿物油，置于充满5%二氧化碳、7%氧气、88%氮气的密闭罐中平衡至少2小时，平衡温度为39摄氏度。

　　1.3.2 受精卵的发育培养

　　受精卵培养24?/FONT>26小时后，将受精卵移入HSOF中，用微量移管反复吹吸受精卵，除去受精卵周围的颗粒细胞。然后将受精卵移置IVC洗涤小滴中，在转入IVC培养小滴中，每小滴受精卵数为10?/FONT>15枚。然后将培养皿放入充满5%二氧化碳、7%氧气、88%氮气的密闭罐中，在温度为39摄氏度培养箱中培养。

　　在胚胎培养的第5天（受精当天为0天），必须将胚胎移置LSOF（晚期培养液）中继续培养2?/FONT>3城。LSOF培养小滴的制备同上。在第5天转移胚胎时，将未卵裂的卵母细胞留在中央的LSOF洗涤小滴中，并可记数卵裂情况。

　　1.4 胚胎质量的评定

　　在胚胎培养的第7天和8天，将培养液从二氧化碳的培养箱中取出，在显微镜下检查胚胎，并评定胚胎的培养效果。记录卵母细胞总数、卵裂细胞总数、致密桑葚胚总数和囊胚总数等。

　　2 实验结果

　　本实验共使用了150个卵巢，分6次进行。前3次，每次用20个卵巢；后3次每次用30个卵巢。所有6批实验均采用注射器从卵巢上吸取卵母细胞，从卵巢上吸取卵母细胞的情况如下表：

　　卵巢吸取卵母细胞情况
批次 卵巢数量 卵母细胞（平均） 可用卵母细胞（平均）
1 20 106（5.3） 67
2 20 63
3 20 81
4 30 92
5 30 81
6 30 69
合计 150 （5.3枚/卵巢） 453（3.02枚/卵巢）

　　注：由于一人操作时间紧，所以在后5批的实验中，只选出卵母细胞的复合体用于实验，其它不可用的卵母细胞没有记数。

　　实验共获得可用卵母细胞453枚，受精率为81.68%（370/453），共获桑葚胚244枚，囊胚126枚，即囊胚率达到27.81%。6批实验的数据如下图：

　　SOF培养系统的体外受精及胚胎培养的效果

批次 卵母细胞 未卵裂数（%） 卵裂胚胎数（%） 囊胚数7天（%） 囊胚数8天（%）

1 67 6（91.04） 61（91.04） 29（44.28）　
2 63 16（25.40） 47（74.60） 11（17.46） 　
3 81 14（17.28） 67（82.72） 11（13.58） 24（29.63）
4 92 13（14.13） 79（85.87） 27（29.35） 33（35.87）
5 81 15（18.52） 66（81.48） 36（44.44）　
6 69 19（24.54） 50（72.46） 12（17.39）
　
合计 453 83（18.23） 370（81.68） 126（27.81）

　　第3、4批实验观察了8天的胚胎发育情况。从上表中可看出，第8天时有的卵裂胚胎可进一步发育成囊胚，而且有相当一部分的囊胚已经孵化。

　　3 结论

　　从上述结果看出，本实验所用的IVM液、IVF液和SOF液对卵母细胞的成熟、精子的获能、精卵的受精结合以及胚胎的生长发育是非常有效的。该结果和一些复杂的共培养系统的培养效果没有差异。

　　4 讨论

　　实验室胚胎生产技术是一项复杂的系统工程。全部过程包括，卵母细胞的采集方法、卵母细胞的成熟培养方法，精子的获能处理方法、精卵的受精培养方法和胚胎的发育培养方法。要想获得理想的实验室胚胎生产效果，必须提高每一步的效率，使整个过程达到最完善的组合。

在卵母细胞的采集方法上主要有两种：一活体采卵，另一种采集屠宰卵巢卵母细胞。采集时真空泵的负压、采卵针的直径大小、甚至针尖斜面的长度等等因素均可影响采集卵母细胞的质量。目前研究表明，牛卵巢采卵时负压40?/FONT>50汞柱、针头为18号针的采卵效果比较理想，此外卵泡的直径大小也影响体外胚胎的生产效果，太大或太小的卵泡均不宜采集。卵泡的直径一般为2?/FONT>7毫米比较适宜。

卵母细胞的成熟培养一般采用TCM99为基础液，添加血清、促进腺激素（FSH/LH）、雌激素（E217β）等，模拟卵泡环境，加速卵母细胞的成熟发育。另外一些研究发现，在基础液中加入发情牛的血清后，不需在加添加激素，卵母细胞的成熟培养效果较好。再不同的实验室，卵母细胞成熟培养时的IVM小滴大小也不同。有些实验室采用多孔微板，甚至小试管作为培养器材，培养液体积为0.6-1.0毫升；而有些实验采用在普通的培养皿上制作10-100微毫升的微小滴，进行各种体外培养。培养滴中的卵母细胞数量也各不相同，一般为10-15枚。最近有研究人员用10微毫升IVM微滴建立起了培养单个卵母细胞的方法。

在体外受精过程中，精子必须经过处理。精子的予处理时离心洗涤，以除去精子表面的去能因子等物质。目前精子的予处理方法有漂浮法（SWIN-UP）和PERCOLL密度梯度离心法两种。本实验采用PERCOLL法分离精子，在IVF液中添加肝素（使精子获能）外，还加钙离子A23187和/或咖啡因，有利于精子获能和受精。IVF和IVM培养方法相同，有采用多孔微板的，也有采用微小滴的。

在胚胎生产过程中除上述因素外，胚胎的生产效果不和实验室的环境条件、配置液体的水质、二氧化碳等培养用的气体等因素有关