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　　动物胚胎移植在一个世纪前已试验成功，近些年来才在畜牧生产中作为提高母畜繁殖力的一项新技术而在实际中应用。60年代以来，对家畜胚胎的采集、保存和移植等技术环节进行了大量试验，取得不少进展。70年代以后，牛的胚胎移植已经有许多发达国家进入了商业生产阶段，成为一种常规的繁殖手段。 　　

　　我国进入70年代开始牛胚胎移植的研究工作，也已取得较大的成功。胚胎移植是将一头良种母畜的早期胚胎取出，移植到生殖生理状态相同的母畜体内，使胚胎在其体内继续发育至胎儿出生。提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。所以，胚胎移植实际上就是产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。

　　一、胚胎移植的意义　

　　胚胎移植可充分发挥优良母牛的繁殖潜力，一般情况下，一头优良成年母牛，一年只能繁殖一头良种犊牛，应用胚胎移植，一年内可得到几头甚至几十头良种犊牛。胚胎移植提高了母牛的繁殖力，便于良种牛群的建立和扩大，有利于选种工作的进行和品种改良规划的实施，是育种工作的有力手段。　　

　　在肉牛中，应用胚胎移植使母牛产双胎，提高生产效率的方法，已产生了实际效果。这种方法称为“诱产双胎”，即对发情的母牛配种后再移植一个胚胎到排卵对侧子宫角内。这样配种后未受胎的母牛可能因接受移植的胚胎而妊娠，而配种后已受孕的母牛由于增加了一个胚胎而怀双胎。另外，也可以对未配种的母牛的两侧子宫角各移植一个胚胎，也可以得到产双胎的效果。据报道，这样处理后的受胎率可高达70%以上，双胎率可达40-60%。另有报道，当向每一侧子宫角移植一个胚胎时，有72%的母牛受胎，其中双胎率可达到73%。因此，采用母牛配种后与胚胎移植相结合，在两侧子宫角内各有一个胚胎是使牛产双胎的有效方法之一。　　

　　应用胚胎移植还可以减少肉用繁殖母牛的饲养头数。可以代替种畜的引进、保存品种资源等。

　　二、胚胎移植的生理基础

　　在发情后的最初一段时期（周期性黄体期），不论是否已受精，生殖系统均处于受精后的生理状态之下，在生理现象上，妊娠与未孕并无区别。所以，发情后母畜生殖器官的孕向变化，是进行胚胎进行移植时，未配种的受体母畜可以接受胚胎，并为胚胎发育提供各种条件的主要生理学根据。

　　胚胎在发育早期有相当一段时期（附植之前）是游离于输卵管或子宫腔内，它的发育靠本身贮存的养分。所以，在离开活体条件下，容易存活。当放回到与供体相同的环境中，继续发育。

　　同一物种之间移植的胚胎没有免疫排斥现象。所以，当胚胎从供体转移至受体时可以存活下来。胚胎必须和受体的子宫内膜建立起生理上和组织上的联系才能保证以后的正常发育。受体对胚胎不产生遗传上的影响，不会改变新生个休的遗传特性。

　　三、胚胎移植的操作原则

　　胚胎移植中必须遵循移植前后所处境的同一性。包括：生理上的一致性，即供体和受体在发情时间上的一致性和解剖部位上的一致性，即移植后的胚胎与移植前所处的空间环境的相似性。胚胎发育的日龄必须与受体发情排卵期的日龄相一致。

　　胚胎采集和移植的期限（胚胎的日龄）不能超过周期黄体的寿命。因此，通常在供体发情配种后3-8日内收集胚胎和移植。

　　移植的胚胎必须经过鉴定，证明是发育正常者。在全部操作过程中，胚胎不应受到任何不良因素（物理的、化学的、微生物的）影响。

　　开展胚胎移植必须有充足的胚胎来源，具备优良品种基因的胚胎必须有保证。

　　四、胚胎移植的技术程序

　　包括超数排卵、供体母牛的配种、胚胎的收集、胚胎的检查、胚胎的保存和胚胎的移植等技术程序。现将其主要的几个技术环节介绍如下：

　　1、超数排卵

　　在母牛发情周期的适当时间，注射促性腺激素，使卵巢中有较多的卵胞发育和排卵，这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时要对供体母牛作超数排卵处理，以便一次取得多枚胚胎。一般认为超排量最好是10个左右，太少会降低胚胎移植的意义，同时胚胎的收集也有困难，超排过多会降低卵子的受精率和收集率。

　　超排处理一般方法为在预计发情到来之前4天， 即发情周期的第16天注射促卵泡素或孕马血清促性腺激素，在出现发情的当天注射绒毛膜激素。

　　目前各国对供体母牛作超数排卵处理方法是供体母牛发情周期的中期肌注孕马血激素以诱导母牛有多数卵泡发育，两天后肌肉注射PGF2a。或其类似物以消除黄体，约2-3天后发情。各国超排处理方法见下表：

　　各国超排处理一览表

　　为了使排出的卵子有较多的受精机会，一般在发情后输精2-3次，每次间隔8-12小时。母牛对超排处理的个体反应差异较大，其原因可能与母牛的品种、年龄、体况、生理状态、制剂质量、投药方法和剂量等各因素有关。

　　2、胚胎的收集

　　从供体收集胚胎的方法有两种：一种是手术法，一种是非手术法。

　　手术法：是按外科剖腹术的要求进行术前准备。手术部位于右胁部或腹下乳房至脐部之间的白线切开。伸进食指找到输卵管和子宫角，引出在切口外。 如果在输精后3-4天期间收集，受精卵绝大多数还未移到子宫角，可采用输卵管冲卵的方法。用注射器吸取冲洗液连接穿刺针头吸取冲洗液连接注射针头，在子宫角前端刺入，再送入输卵管峡部，注入冲洗液。 如果在输精5天后收集， 还必须作子宫角取卵。 可在子宫角中段插入橡胶双套管，从外管送入空气，使橡皮管顶端的气球膨大紧贴子宫内壁，橡皮管的另一端连接集卵器，然后从子宫角前端插入针头，注入冲洗液3-4次， 尽量把冲洗液全部收回在试管或平皿中。

　　非手术法：非手术法是在输精后5-7天进行。可采用二路或三路导管的冲卵器。 二路式冲卵器。二路式冲卵器由带气囊的导管与单路管组成。导管中一路为注入和回收冲洗液用。导管用直肠把握法从子宫颈导入子宫角。通过气囊导管打入空气，使气囊膨胀以固定导管在子宫角内的位置和防止冲洗液倒流。冲洗液经单路管注入子宫角，每次15-50毫升，然后将冲洗液收集在漏斗形容器内。 冲洗5-6次。为更多地回收冲洗液，可在直肠内轻轻按摩子宫角。　

　　冲洗液多数为组织培养液， 如林格氏液、杜氏磷酸缓冲液、布林斯特氏液（BMOC-3）和TCM-199等。常用的为杜氏磷酸缓冲液（PBS）， 加入0.4%的牛血清蛋白或1-10%小牛血清。布林斯特氏液效果也较好。这两个培养液的成分见下表。

　　组织培养液成分（克/100毫升双蒸馏水）

　　冲洗液使用时温度应为35-70℃， 每毫升要加入青霉素1000单位，链霉素500-1000微克，以防止生殖道感染。

　　把上述方法所回收的冲洗液于室温或37℃温箱内静置10分钟。待胚胎下沉后，移去上层液，取底部少量液体移至平皿内，先在10-20倍的解剖镜下检查胚胎数量， 然后在较大倍数（50-100倍）下观察胚胎发育情况。把正常发育的胚胎收集于带有密闭盖的玻璃容器内备用贮存。

　　正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象（未受精）和异常卵（外膜破裂，卵裂球破裂等）都不能用于胚胎移植。

　　3、胚胎的移植

　　胚胎移植也分为手术法和非手术法。在诱产双胎为目的的移植一般采用非手术法。手术法如前所述先将受体母牛作好术前准备，在右胁部切口，找到非排卵侧子宫角（已配种母牛），再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注入胚胎；或在每侧子宫角各注入一个胚胎（未配母牛）。注入完毕后即将子宫复位，进行伤口缝合。

　　非手术法移植是用人工授精输精器（卡苏枪）或专用移卵器按照直肠把握输精方法插入非排卵侧子宫角深部，注入胚胎。非手术法的移植在发情周期的6-9天进行（即胚泡阶段），效果较好。非手术法不损害受体的健康，操作简便，但是还需要克服所注入胚胎易被排出的问题。非手术法移植时要严格遵守无菌操作规程，以防止生殖道感染。 　

　　不论用何种方法移植胚胎，供体和受体的发情期应相同或前后相差不超过24小时，否则，将会影响成功率。所以在胚胎体外保存方法没有得到较好的解决之前，必须对供体和受体同时进行同期发情处理，使两者性腺和生殖道处于相同的生理状态，　以提高移植成活率。对供体和受体于术后要注意观察是否发情。供体发情时即可正常配种，或经过40-80天再重复作为供体。受体母牛如未发情，在适当时间进行妊娠检查。若确已妊娠，应加强饲养管理。诱产双胎的受体母牛以成年母牛较好，可以减少分娩困难。

　　4、胚胎的保存

　　如果胚胎能在体外较长期的保存，并使它保持于取卵时状态，对胚胎移植的实际应用有很大的意义。这样就可以免去移植时要求的同期发情处理。可以不受时间、地点和选定受体母牛的限制，随时随地可以进行胚胎移植。胚胎保存的研究近年来发展很快，并已取得了一定的进展。　　

　　在前述培养液中， 如在室温或体温条件下， 胚胎只能存活10-20小时。 当温度降至20℃以下时，胚胎即停止发育，存活时间可以延长。在10℃以下可以存活数日。将牛的胚胎在兔的输卵管内可保存3-4天。据报道，将曾在母兔输卵管内保存3-4天的牛胚胎移植到同期化受体青年母牛，胚胎成活率可达73%。但是上述方法在时间上是短暂的，受胎率也不高。目前冷冻保存胚胎的研究已取得了成果。 　

　　用于冷冻保存的胚胎以6-7日龄胚胎，即桑椹期至胚泡开始出现时的胚胎效果较好。 　

　　胚胎冷冻前必须使其脱水，进行冷冻保护剂二甲基亚矾（DM-SO）的渗透处理。在室温下（20℃）， 预先配制含有DMSO浓度为0.25摩尔、0.5摩尔、1.0摩尔、1.5摩尔的加0.4%牛血清白蛋白的PBS溶液（磷酸缓冲液）。将胚胎依次浸入上述不同DMSO浓度的溶液中进行渗透处理，在每个浓度溶液中分别停留5-10分钟。最后用吸管将含胚胎的0.3毫升的长颈安瓶中，并将口封好。以上操作均在解剖镜下进行，然后将安瓿置于14℃的水浴中。

　　胚胎冷冻以液氮为冷源。在可控制温度的液氮冷冻箱内进行。冷冻速率以英国为例：14℃至-7℃每分钟下降1℃，于-7℃时用在液氮中浸过的金属镊子夹一下有胚胎的安瓿，使之诱导结晶，胚胎迅速被玻璃化冻结，而不致产生有害的冰结晶。-7℃至-36℃每次分钟下降0.3，-36℃至-60℃每分钟下降0.1℃，-60℃时直接投入液氮中保存。

　　胚胎的解冻比冷冻速度快，-196℃至-50℃（干冰酒精溶液中），-50℃至14℃每分钟升温4℃。解冻后，通常在室温下将安瓿打开，脱去冷冻保护剂DMSO。 方法是将胚胎依次移入含DMSO浓度为1.25摩尔、1.0摩尔、0.75摩尔、0.5摩尔的磷酸缓冲液中，在每种浓度溶液中各停留5-10分钟， 0.5摩尔溶液中可停留30分钟，最后移入不含DMSO的磷酸缓冲溶液中停留10分钟。 再用磷酸缓冲液冲洗二次，取出后检查即可用于移植，也可以培养1小时（在37℃培养液中），将其中死的胚胎去掉，效果更好。

　　据报道，三头杂种牛的7日龄胚胎在移植前置于液氮中保存34-38天，给16头受体母牛每头输胚一个，结果有3头受胎。又据报道，一头良种牛的胚胎在液氮中保存46天后移植到另一头母牛体内，结果产下一头公犊。

　　从以上情况看，冷冻保存胚胎虽然冻后成活率和受胎率还很低，还需要在培养液、防冻保护剂、降温和升温速率等问题进行深入的研究。但是这确是胚胎保存技术的重大突破。

　　五、胚胎移植的效果

　　据我们移植实验，胚胎移植的成功率，即受体妊娠率，鲜胚移植达60-70%，冻胚也达到45-50%，半胚移植达55.6%。